Smad6 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401411-ACT

O SMAD6 humano codifica a Smad6, um SMAD inibitório que atenua a sinalização a jusante da superfamília TGF-β, particularmente no ramo de BMP. A Smad6 atua como regulador de feedback negativo ao interferir na fosforilação dos SMADs regulados por receptores e ao modular a formação de complexos de SMAD e o output transcricional. Por meio desses mecanismos, influencia o padrão de desenvolvimento, a diferenciação osteogênica, a homeostase endotelial e vascular e a comunicação cruzada com a sinalização inflamatória. Alterações na atividade ou na expressão de SMAD6 têm sido associadas a fenótipos cardiovasculares e craniofaciais congênitos e vêm sendo estudadas em contextos nos quais o desequilíbrio das vias BMP/TGF-β contribui para processos de remodelamento e calcificação relevantes para doenças.

Smad6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMAD6 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Smad6 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMAD6 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMAD6, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Smad6. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMAD6 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Smad6 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Smad6 em células tumorais com expressão de SMAD6 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.