Plasmide CRISPR d'Activation (h) SLP-76: sc-401421-ACT

LCP2 code pour SLP-76, une protéine adaptatrice cytosolique essentielle au couplage de l’engagement des immunorécepteurs aux voies de signalisation en aval dans les cellules hématopoïétiques. Après stimulation du récepteur des cellules T ou des récepteurs Fc, SLP-76 sert de plateforme d’assemblage à des complexes multiprotéiques avec LAT, VAV1, ITK et PLCγ, afin de coordonner des cascades de phosphorylation qui régulent les flux calciques, l’activation des MAPK, le remodelage du cytosquelette et des programmes transcriptionnels gouvernant l’activation et la différenciation des lymphocytes. Par ces voies, SLP-76 influence l’adhérence médiée par les intégrines, la formation de la synapse immunologique et les réponses effectrices, ce qui en fait un nœud central pour l’étude de la dynamique de signalisation des récepteurs de l’antigène. Une dérégulation de la signalisation proximale impliquant les réseaux associés à SLP-76 est pertinente dans les dysfonctionnements immunitaires et les phénotypes inflammatoires, ce qui justifie son utilisation dans des modèles mécanistiques de signalisation des cellules immunitaires.

SLP-76 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LCP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SLP-76 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LCP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LCP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SLP-76. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LCP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SLP-76 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SLP-76 dans les cellules tumorales présentant une expression de LCP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.