Ski CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422964-ACT

Mouse Ski (Sloan-Kettering Viral-Onkogen-Homolog) kodiert einen nukleären Transkriptionsregulator, der Genexpressionsprogramme moduliert, welche Proliferation, Differenzierung und Linienfestlegung steuern. SKI ist vor allem als negativer Regulator der TGF-β/SMAD-Signalübertragung bekannt: Es kann SMAD-abhängige Transkription reprimieren und die epithelial-mesenchymale Transition, den Umbau der extrazellulären Matrix sowie immunbezogene Transkriptionsantworten beeinflussen. Über Crosstalk mit Signalwegen wie der BMP-Signalkaskade und mit chromatinassoziierten Koregulatoren wirkt SKI auf Entwicklungsmusterung und Gewebehomöostase ein. Veränderte SKI-Expression oder -Aktivität wurde mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Fibrose, Krebsbiologie sowie kraniofaziale oder skelettale Entwicklung relevant sind, was SKI zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Signalwegstudien macht.

Ski Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ski-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ski Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ski-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ski-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ski-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ski-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ski-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ski-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ski-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.