SIRT3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400675-ACT

La SIRT3 umana codifica una deacetilasi mitocondriale NAD+-dipendente che regola l’acetilazione proteica per coordinare il metabolismo ossidativo, la biogenesi mitocondriale e l’omeostasi redox. Deacetilando bersagli coinvolti nell’ossidazione degli acidi grassi, nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e nella funzione della catena di trasporto degli elettroni, SIRT3 influenza la produzione di ATP, la detossificazione delle ROS e i percorsi di controllo qualità mitocondriale come la mitofagia. L’attività di SIRT3 collega il sensing dei nutrienti e le risposte allo stress ai programmi di sopravvivenza cellulare, con effetti a valle sulla segnalazione AMPK/PGC-1α e sulle difese antiossidanti, incluso il tamponamento delle ROS dipendente da SOD2. Un’espressione o un’attività deregolata di SIRT3 è stata associata a fenotipi di disfunzione mitocondriale rilevanti per la biologia delle malattie metaboliche, la ricerca sulla neurodegenerazione e gli studi sul metabolismo del cancro.

SIRT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIRT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SIRT3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIRT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIRT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SIRT3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIRT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SIRT3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SIRT3 nelle cellule tumorali con espressione di SIRT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.