SIRT3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400675-ACT

Humanes SIRT3 kodiert eine mitochondriale, NAD+-abhängige Deacetylase, die die Proteinacetylierung reguliert, um oxidativen Stoffwechsel, mitochondriale Biogenese und Redox-Homöostase zu koordinieren. Durch die Deacetylierung von Zielproteinen, die an der Fettsäureoxidation, dem TCA-Zyklus und der Funktion der Elektronentransportkette beteiligt sind, beeinflusst SIRT3 die ATP-Produktion, die Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie mitochondriale Qualitätskontrollwege wie die Mitophagie. Die SIRT3-Aktivität verknüpft Nährstoffsensorik und Stressantworten mit zellulären Überlebensprogrammen und wirkt nachgeschaltet auf die AMPK/PGC-1α-Signalgebung und antioxidative Abwehrmechanismen, einschließlich einer SOD2-abhängigen ROS-Pufferung. Eine dysregulierte SIRT3-Expression oder -Aktivität wurde mit Phänotypen der mitochondrialen Dysfunktion in Verbindung gebracht, die für die Biologie metabolischer Erkrankungen, die Neurodegenerationsforschung und Studien zum Tumormetabolismus relevant sind.

SIRT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIRT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIRT3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIRT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIRT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIRT3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIRT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIRT3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIRT3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIRT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.