Plásmido CRISPR de Activación (h) SIM1: sc-405931-ACT

El SIM1 humano (single-minded homolog 1) codifica un factor de transcripción bHLH-PAS que regula la especificación del linaje neuronal y los programas transcripcionales necesarios para el desarrollo del hipotálamo y la homeostasis neuroendocrina. SIM1 actúa mediante la heterodimerización con socios de la familia ARNT y la integración de señales del dominio PAS para controlar redes génicas implicadas en la regulación del apetito, el equilibrio autonómico y el gasto energético. La alteración de la dosis de SIM1 o la disrupción de su regulación se asocian con disfunción hipotalámica y fenotipos relacionados con la obesidad, lo que lo convierte en un nodo útil para estudiar el control transcripcional de las vías metabólicas. En modelos celulares y tisulares, SIM1 ofrece un punto de entrada manejable para diseccionar circuitos transcripcionales del desarrollo, la lógica de los potenciadores (enhancers) y la señalización neuropeptídica aguas abajo.

SIM1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SIM1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SIM1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SIM1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SIM1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SIM1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SIM1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SIM1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SIM1 en células tumorales con expresión de SIM1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.