Plásmido CRISPR de Activación (h) SHARPIN: sc-404836-ACT

SHARPIN (interactor del dominio RH asociado a SHANK) es una proteína adaptadora multifuncional que actúa como componente esencial del complejo de ensamblaje de cadenas lineales de ubiquitina (LUBAC), favoreciendo la ubiquitinación vinculada a Met1 y la propagación de la señalización canónica de NF-κB. Mediante la regulación de nodos de señalización del receptor de TNF y de la inmunidad innata, SHARPIN influye en programas transcripcionales inflamatorios, la supervivencia celular y las respuestas al estrés, y también contribuye a la adhesión mediada por integrinas y a la dinámica del citoesqueleto. La actividad desregulada de SHARPIN se ha relacionado con alteraciones de la homeostasis inmunitaria y fenotipos inflamatorios crónicos, y con frecuencia se estudia en el contexto de redes de señalización oncogénica que moldean la aptitud de las células tumorales y la inflamación del microambiente. Como resultado, SHARPIN es una diana útil para analizar el control de vías dependientes de ubiquitina y la transcripción sensible a estímulos.

SHARPIN El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SHARPIN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SHARPIN El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SHARPIN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SHARPIN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SHARPIN. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SHARPIN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SHARPIN en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SHARPIN en células tumorales con expresión de SHARPIN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.