SERCA3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402840-ACT

ATP2A3 kodiert die menschliche sarco-/endoplasmatische Retikulum-Ca2+-ATPase SERCA3, eine ATP-abhängige Pumpe, die zytosolisches Ca2+ in das endoplasmatische Retikulum transportiert, um nach Signalereignissen basale Calciumspiegel wiederherzustellen. Durch die Formung der ER-Ca2+-Speicher und zytosolischer Ca2+-Transienten beeinflusst SERCA3 calciumabhängige Prozesse, darunter Sekretion, Rezeptorsignalisierung, Transkriptionsprogramme und ER-Stressantworten. Die SERCA3-Aktivität trägt zur intrazellulären Calciumhomöostase bei, die mit der Regulation der Apoptose, der Signalgebung der Unfolded-Protein-Response sowie weiteren Ca2+-regulierten Kinase- und Phosphatasewegen verknüpft ist. Eine veränderte Expression von Mitgliedern der SERCA-Familie wurde mit der fehlregulierten Calciumsignalisierung in unterschiedlichen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, wodurch ATP2A3 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur Zellphysiologie und Stressadaptation darstellt.

SERCA3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP2A3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SERCA3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP2A3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP2A3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SERCA3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP2A3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SERCA3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SERCA3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP2A3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.