SASH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403567-ACT

SASH1 (SAM and SH3 domain containing 1) codifica uma proteína citoplasmática do tipo scaffold/adaptadora, implicada na organização de complexos de transdução de sinal a jusante de receptores e de estímulos de estresse. Em células humanas, o SASH1 tem sido associado à regulação da dinâmica do citoesqueleto, da adesão celular, da migração e de processos ligados à barreira endotelial, em linha com funções no controle da proliferação e da arquitetura tecidual. Alterações na expressão de SASH1 e variações genéticas têm sido relatadas em múltiplos contextos de doença, incluindo biologia tumoral e fenótipos vasculares ou pigmentares, o que o torna um nó útil para estudar saídas de sinalização dependentes do contexto. Essas funções posicionam SASH1 como um alvo de pesquisa para dissecar vias que acoplam a sinalização extracelular a programas transcricionais e à motilidade celular.

SASH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SASH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SASH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SASH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SASH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SASH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SASH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SASH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SASH1 em células tumorais com expressão de SASH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.