Sar1a Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404190-ACT

O SAR1A humano codifica a Sar1a, uma pequena GTPase associada ao COPII que inicia o brotamento de vesículas de transporte a partir do retículo endoplasmático e sustenta o tráfego do RE para o Golgi. Ao alternar entre os estados ligados a GDP e a GTP, a Sar1a recruta os componentes do revestimento Sec23/24 e Sec13/31 para regular a seleção de carga, a curvatura das vesículas e o fluxo secretório. O tráfego dependente de SAR1A interage com vias de proteostase, incluindo a sinalização de estresse do RE e a resposta a proteínas mal dobradas (UPR), influenciando o processamento celular de proteínas de membrana e secretadas. Dinâmicas desreguladas da via secretória e da homeostase do RE são comumente implicadas em fenótipos relevantes para doenças, como deposição alterada de matriz extracelular, tráfego aberrante de receptores e sinalização adaptativa ao estresse em células transformadas.

Sar1a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SAR1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Sar1a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SAR1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SAR1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Sar1a. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SAR1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Sar1a no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Sar1a em células tumorais com expressão de SAR1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.