Plasmide CRISPR d'Activation (h) saposin: sc-401394-ACT

PSAP code la prosaposine, un précurseur lysosomal qui est transformé par protéolyse en saposines A à D, des protéines activatrices essentielles des hydrolases des sphingolipides. En facilitant le catabolisme des glycosphingolipides et des céramides, les saposines soutiennent la fonction lysosomale, le renouvellement des lipides membranaires et l’homéostasie endolysosomale, reliant ainsi PSAP aux voies autophagie–lysosome et aux réponses au stress cellulaire. Une perturbation de la maturation de la prosaposine ou de l’activité des saposines dérègle le métabolisme des sphingolipides, entraînant des phénotypes de surcharge lipidique et une pathologie cellulaire associée à la neurodégénérescence. Par conséquent, PSAP est largement étudié dans des modèles de maladies de surcharge lysosomale, de maintien de la myéline et d’inflammation induite par une signalisation lipidique altérée.

saposin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PSAP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

saposin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PSAP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PSAP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de saposin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PSAP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de saposin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie saposin dans les cellules tumorales présentant une expression de PSAP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.