Plasmide CRISPR d'Activation (h) SAC1: sc-404467-ACT

Le gène humain **SACM1L** code **SAC1**, une phosphatase des phosphoinositides associée au réticulum endoplasmique et à l’appareil de Golgi, qui hydrolyse le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) afin de maintenir la composition lipidique des organites. En contrôlant les réserves de PI4P, SAC1 régule le trafic membranaire, l’intégrité du Golgi et les échanges lipidiques aux sites de contact RE–Golgi, influençant le flux de la voie sécrétoire et l’homéostasie cellulaire. La signalisation des phosphoinositides dépendante de SAC1 s’articule avec des voies plus larges qui gouvernent le bourgeonnement des vésicules, le tri du cargo et l’adaptation au stress dans le réseau sécrétoire précoce. Une activité dérégulée de SACM1L et un déséquilibre du PI4P ont été associés à des modifications de la dynamique membranaire et des états de signalisation pertinents pour la biologie des maladies prolifératives et neurodéveloppementales.

SAC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SACM1L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SAC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SACM1L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SACM1L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SAC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SACM1L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SAC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SAC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SACM1L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.