Plásmido CRISPR de Activación (h) RyR: sc-401470-ACT

El gen humano **RYR1** codifica el receptor de rianodina (**RyR1**), un canal tetramérico de liberación de Ca²⁺ del retículo sarcoplásmico/endoplásmico que acopla la despolarización de membrana con una rápida movilización de calcio intracelular. Los transitorios de Ca²⁺ impulsados por RyR1 regulan el acoplamiento excitación–contracción, la liberación de calcio inducida por calcio y vías de señalización posteriores que modulan el metabolismo mitocondrial, la dinámica del citoesqueleto y las respuestas transcripcionales al calcio. La actividad de RYR1 está estrechamente controlada por el Ca²⁺ luminal, el estado redox y proteínas accesorias como FKBP12, la calmodulina y los complejos triadina/junctina. La alteración de la compuerta del canal RyR1 y la homeostasis anómala de Ca²⁺ se asocian con la fisiopatología del músculo esquelético y se estudian con frecuencia en el contexto de la susceptibilidad a la hipertermia maligna y las miopatías congénitas.

RyR-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RYR1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RyR-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RYR1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RYR1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RyR-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RYR1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RyR-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RyR-1 en células tumorales con expresión de RYR1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.