Plásmido CRISPR de Activación (h) RyR: sc-402986-ACT

El gen humano RYR2 codifica el receptor de rianodina 2 (RyR2), un gran canal de liberación de Ca²⁺ del retículo sarcoplásmico/endoplásmico que coordina el acoplamiento excitación–contracción al moldear los transitorios de calcio citosólico. La actividad de RyR2 integra entradas de señalización de las vías de AMPc/PKA y CaMKII y se acopla a la liberación de calcio inducida por calcio, al metabolismo mitocondrial y a programas transcripcionales aguas abajo. La alteración de la expresión de RYR2 o de la regulación del canal perturba la homeostasis de Ca²⁺, favoreciendo ondas de calcio aberrantes y una señalización electrofisiológica modificada en cardiomiocitos. La disfunción de RYR2 se asocia a fenotipos del ritmo cardíaco tanto hereditarios como adquiridos, lo que lo convierte en un nodo clave para estudios mecanísticos del manejo del calcio y de las respuestas celulares al estrés.

RyR-2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RYR2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RyR-2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RYR2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RYR2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RyR-2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RYR2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RyR-2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RyR-2 en células tumorales con expresión de RYR2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.