Rubicon CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432438-ACT

Das Mausgen 1700021K19Rik kodiert Rubicon (RUN-domain- und cysteinreiche Domäne enthaltendes, mit Beclin 1 interagierendes Protein), einen Regulator des Membrantransports, der Autophagie und endolysosomale Reifung moduliert. Rubicon ist vor allem dafür bekannt, die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen durch Interaktionen mit dem Beclin-1–VPS34-Klasse-III-PI3K-Komplex zu hemmen, und die LC3-assoziierte Phagozytose zu beeinflussen, wodurch lysosomaler Abbau, Entzündung und zelluläre Stressantworten geprägt werden. Durch die Kontrolle des Flusses durch autophagische und phagozytische Wege kann Rubicon die mitochondriale Qualitätskontrolle, die antimikrobielle Abwehr und Zytokinproduktionsprogramme beeinflussen, die für Neurodegeneration, metabolische Dysfunktion und immunvermittelte Pathologien relevant sind. Diese Funktionen machen Rubicon zu einem nützlichen Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie Vesikeltransport und lysosomenabhängiger Turnover die Homöostase in verschiedenen Maus-Zelltypen steuern.

Rubicon Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen 1700021K19Rik-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rubicon Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des 1700021K19Rik-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der 1700021K19Rik-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rubicon-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native 1700021K19Rik-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rubicon-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rubicon-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem 1700021K19Rik-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.