Plasmide CRISPR d'Activation (h) RSP3: sc-413513-ACT

RSPH3 code la protéine 3 de la tête des rayons radiaux (RSP3), un composant structural d’échafaudage du complexe des rayons radiaux de l’axonème, qui relie les microtubules des doublets externes à l’appareil de la paire centrale dans les cils et flagelles motiles. RSP3 contribue à une régulation adéquate de la dynéine et à la coordination du battement ciliaire, participant ainsi à l’écoulement des fluides entraîné par les cils et à la clairance mucociliaire. L’altération de l’architecture des rayons radiaux perturbe la fonction des cils motiles et est impliquée dans des phénotypes de ciliopathie, notamment certaines formes de dyskinésie ciliaire primitive et des défauts de motilité des spermatozoïdes associés à l’infertilité. En conséquence, RSPH3 est largement étudié dans les voies régissant l’assemblage de l’axonème, l’intégration de la signalisation ciliaire et la physiologie de la barrière épithéliale.

RSP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RSPH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RSP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RSPH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RSPH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RSP3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RSPH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RSP3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RSP3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RSPH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.