Plásmido CRISPR de Activación (h) RPE65: sc-401489-ACT

RPE65 codifica una isomerohidrolasa de retinoides esencial para el ciclo visual en el epitelio pigmentario de la retina, catalizando la conversión de ésteres de retinilo all-trans en 11-cis-retinol para sostener la regeneración de la rodopsina. Esta actividad favorece la fototransducción al mantener la disponibilidad del cromóforo y vincula el metabolismo de los retinoides con procesos celulares que incluyen el transporte de retinol, la esterificación y las respuestas al estrés oxidativo en la retina externa. Las alteraciones en la expresión o la función de RPE65 se asocian con un reciclaje deficiente del cromóforo y disfunción de los fotorreceptores, lo que la convierte en un nodo clave para estudiar la homeostasis retiniana. Los modelos in vitro que aprovechan la modulación de RPE65 se utilizan para investigar la regulación transcripcional del ciclo visual y los cambios de señalización posteriores relevantes para fenotipos de degeneración retiniana.

RPE65 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RPE65 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RPE65 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RPE65 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RPE65, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RPE65. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RPE65 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RPE65 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RPE65 en células tumorales con expresión de RPE65 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.