Plásmido CRISPR de Activación (h) RPB2: sc-402591-ACT

POLR2B codifica RPB2, la segunda subunidad catalítica más grande de la ARN polimerasa II, que sintetiza ARNm y muchos ARN no codificantes esenciales para la expresión génica en eucariotas. RPB2 contribuye a la apertura del promotor, la incorporación de nucleótidos y la procesividad transcripcional, acoplando la transcripción al procesamiento de ARN cotranscripcional y a la regulación de la cromatina. Como componente central de la maquinaria basal de transcripción, POLR2B respalda vías que gobiernan la progresión del ciclo celular, la diferenciación y las respuestas al estrés mediante el control global de la producción transcripcional. La desregulación de la función de la ARN polimerasa II y de la homeostasis transcripcional es ampliamente relevante para la biología de enfermedades proliferativas y del neurodesarrollo, donde los programas de expresión génica alterados constituyen un mecanismo central.

POLR2B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLR2B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

POLR2B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLR2B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLR2B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de POLR2B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLR2B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de POLR2B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía POLR2B en células tumorales con expresión de POLR2B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.