Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rootletin: sc-401646-ACT

CROCC code pour la rootlétine, une grande protéine cytosquelettique à domaines en hélice enroulée (coiled-coil) qui polymérise en racines ciliaires et contribue à la cohésion du centrosome, à l’ancrage du corpuscule basal et à la ciliogenèse. La rootlétine sert d’échafaudage à l’architecture centrosomale et soutient l’organisation des microtubules nécessaire à la progression du cycle cellulaire et au maintien de la polarité épithéliale. Par son rôle dans la formation du cil primaire et l’intégrité du centrosome, CROCC est impliqué dans des voies qui gouvernent la signalisation dépendante des cils et la fidélité de la mitose. La dérégulation de ces processus est associée à des phénotypes liés aux ciliopathies et, plus largement, à des défauts d’homéostasie tissulaire liés à une structure ciliaire anormale ou à une altération de la fonction centrosomale.

Rootletin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CROCC sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rootletin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CROCC dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CROCC, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rootletin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CROCC natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rootletin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rootletin dans les cellules tumorales présentant une expression de CROCC silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.