Plásmido CRISPR de Activación (r) Rock-2: sc-437370-ACT

La quinasa 2 asociada a Rho que contiene un dominio coiled-coil (ROCK2; Rock-2) es una quinasa de serina/treonina que actúa aguas abajo de RhoA para regular la contractilidad actomiosínica, la formación de fibras de estrés, la dinámica de las adhesiones focales y la remodelación del citoesqueleto. Mediante la fosforilación de sustratos como la cadena ligera de miosina y las quinasas LIM, ROCK2 integra la señalización Rho/ROCK con vías que controlan la forma celular, la motilidad, la retracción de neuritas y el tono del músculo liso. En modelos de rata, la actividad alterada de ROCK2 se estudia con frecuencia en el contexto del remodelado vascular, la fibrosis, la neuroinflamación y las respuestas a lesiones, donde una tensión citosquelética aberrante y la migración celular contribuyen a la patología. La señalización dependiente de ROCK2 también es relevante para la mecanotransducción y para transiciones de tipo epitelio–mesénquima en diversos tejidos, lo que respalda su uso como un nodo para analizar fenotipos impulsados por la contractilidad.

Rock-2 El plásmido de activación CRISPR (r) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rock-2 El plásmido de activación CRISPR (r) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional , donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rock-2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rock-2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rock-2 en células tumorales con expresión de silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.