Plásmido CRISPR de Activación (h) RNGTT: sc-405280-ACT

El gen humano **RNGTT** codifica la ARN guanililtransferasa y 5′-fosfatasa que cataliza pasos clave del caperuzado 5′ del ARNm, convirtiendo los trifosfatos 5′ del ARN naciente en la caperuza m7G en coordinación con metiltransferasas y con la maquinaria de transcripción. Esta estructura de caperuza es esencial para el procesamiento del pre-ARNm, la exportación nuclear, el inicio de la traducción y la protección frente a exonucleasas, lo que vincula la actividad de RNGTT con la transcripción acoplada a la ARN polimerasa II y con programas globales de expresión génica. Al influir en la estabilidad del ARNm y en la eficiencia de traducción, RNGTT se cruza con vías que regulan la progresión del ciclo celular, las respuestas al estrés y la detección inmunitaria innata de ARN sin caperuza. La desregulación del caperuzado del ARNm y del control de la traducción dependiente de la caperuza es ampliamente relevante para la biología de enfermedades proliferativas y del neurodesarrollo, lo que convierte a RNGTT en un nodo útil para estudios mecanísticos del metabolismo del ARN.

RNGTT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RNGTT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RNGTT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RNGTT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RNGTT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RNGTT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RNGTT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RNGTT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RNGTT en células tumorales con expresión de RNGTT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.