RNF8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401909-ACT

RNF8 kodiert eine E3-Ubiquitin-Ligase, die als früher Signalverstärker in der DNA-Schadensantwort fungiert, indem sie an Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen die Ubiquitinierung katalysiert und so die Rekrutierung von Reparaturfaktoren koordiniert. Durch Interaktionen mit MDC1 und eine phosphorylierungsabhängige Andockung an geschädigtes Chromatin fördert RNF8 die ubiquitinabhängige Assemblierung nachgeschalteter Mediatoren wie 53BP1 und BRCA1 und beeinflusst damit die Wahl des Reparaturwegs zwischen nicht-homologem End-Joining und homologer Rekombination. Die RNF8-Aktivität verknüpft zudem die Genomüberwachung mit der Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints und Chromatin-Remodelling und trägt so dazu bei, die genomische Stabilität unter Replikationsstress aufrechtzuerhalten. Eine fehlregulierte RNF8-Signalgebung wurde mit veränderter DNA-Reparaturkapazität und Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und die Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Stressoren relevant sind.

RNF8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNF8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNF8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNF8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNF8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.