RNF185 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416413-ACT

RNF185 kodiert eine RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die vor allem mit dem endoplasmatischen Retikulum und den mitochondrienassoziierten Membranen verbunden ist, wo sie zur Regulation der Proteinkontrolle und der Homöostase von Organellen beiträgt. Durch die Katalyse der Ubiquitinierung spezifischer Substrate beeinflusst RNF185 Proteostase-Wege, darunter die ER-assoziierte Degradation und stressadaptive Signalübertragung, mit nachgelagerten Effekten auf die mitochondriale Dynamik. Beschriebene Funktionen in der selektiven Autophagie und der Regulation der angeborenen Immunantwort verknüpfen RNF185 mit Mechanismen, die zelluläre Reaktionen auf geschädigte Proteine und Organellen koordinieren. Fehlregulierte Ubiquitin-Signalgebung und eine beeinträchtigte Proteostase sind wiederkehrende Merkmale in Neurodegeneration, Stoffwechselerkrankungen und der Krebsbiologie, wodurch RNF185 einen hilfreichen Knotenpunkt für pathway-orientierte Forschung darstellt.

RNF185 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF185-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNF185 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF185-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF185-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNF185-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF185-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNF185-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNF185-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF185-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.