Plasmide CRISPR d'Activation (h) RILP: sc-402680-ACT

RILP (Rab-interacting lysosomal protein) est un effecteur clé de Rab7 qui coordonne le positionnement, la maturation et le trafic de cargaison des endosomes tardifs et des lysosomes le long des microtubules. En reliant les membranes positives pour Rab7 au complexe moteur dynéine–dynactine et en participant aux événements de fusion endosome–lysosome, RILP influence la diminution des récepteurs, la dégradation lysosomale et le flux autophagique. Ces fonctions placent RILP au centre de l’homéostasie endolysosomale et des voies de trafic membranaire qui façonnent la sortie des signaux et la protéostasie. La dérégulation du transport dépendant de Rab7–RILP a été associée à des réponses au stress cellulaire et à des phénotypes pertinents pour la neurodégénérescence, la biologie des infections et l’adaptation des cellules cancéreuses à une fonction lysosomale altérée.

RILP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RILP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RILP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RILP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RILP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RILP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RILP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RILP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RILP dans les cellules tumorales présentant une expression de RILP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.