RIG-I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400812-ACT

DDX58 kodiert die zytosolische RNA-Helikase RIG-I, einen zentralen Mustererkennungsrezeptor, der kurze doppelsträngige RNA sowie 5′-triphosphorylierte virale RNA erkennt. Nach Ligandenbindung signalisiert RIG-I über MAVS und aktiviert die IRF3/IRF7- und NF-κB-Signalwege, wodurch Typ-I-Interferone und proinflammatorische Zytokine als Teil der angeborenen antiviralen Immunabwehr induziert werden. Diese Achse ist in umfassendere Programme interferon-stimulierter Gene eingebunden, umfasst immunmetabolische Umbaureaktionen und steht bei zellulärem Stress in Wechselwirkung mit Autophagie und Apoptose. Eine fehlregulierte RIG-I-Signalgebung wurde mit veränderter antiviraler Reaktionsfähigkeit und entzündlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Infektionsbiologie und immunvermittelte Krankheitsmechanismen relevant sind.

RIG-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDX58-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RIG-I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDX58-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDX58-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RIG-I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDX58-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RIG-I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RIG-I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDX58-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.