Plásmido CRISPR de Activación (h) Ribophorin I: sc-402286-ACT

RPN1 codifica la riboforina I, un componente esencial del complejo oligosacariltransferasa (OST) incrustado en la membrana del retículo endoplásmico rugoso, que sustenta la glicosilación N‑ligada cotraduccional de proteínas secretoras y de membrana nacientes. Al coordinar la transferencia de glicanos y la maduración proteica, la riboforina I contribuye a la proteostasis del RE, al control de calidad y al tráfico a través de la vía secretora, con efectos posteriores sobre la señalización de receptores y la composición del proteoma de la superficie celular. La alteración de la capacidad de glicosilación del RE y la desregulación de subunidades del OST se han vinculado a respuestas de estrés celular y a un procesamiento proteico aberrante observado en múltiples contextos relevantes para enfermedades, lo que convierte a RPN1 en un nodo útil para estudiar la biogénesis de glicoproteínas. La modulación experimental de la expresión de RPN1 ayuda a investigar cómo la maquinaria de glicosilación residente en el RE determina la eficiencia de plegamiento, la degradación mediante la degradación asociada al RE (ERAD) y la estabilidad más amplia del proteoma.

Ribophorin I El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RPN1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ribophorin I El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RPN1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RPN1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ribophorin I. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RPN1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ribophorin I en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ribophorin I en células tumorales con expresión de RPN1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.