Plásmido CRISPR de Activación (h) Rfp2: sc-403870-ACT

TRIM13 (Rfp2) es una ligasa E3 de ubiquitina humana con dominio RING finger, enriquecida en el retículo endoplásmico, donde regula la homeostasis proteica al catalizar la ubiquitinación y dirigir sustratos hacia su degradación por el proteasoma. Participa en la degradación asociada al RE y en un control más amplio del sistema ubiquitina–proteasoma, influyendo en las respuestas celulares a proteínas mal plegadas, al estrés oxidativo y a la apoptosis. Mediante la modulación de componentes de señalización y de vías de control de calidad, Rfp2 puede afectar programas inflamatorios y de supervivencia que determinan decisiones sobre el destino celular. Se han descrito alteraciones en la expresión o actividad de TRIM13 en estudios de biología del cáncer y de desequilibrios de proteostasis asociados a la neurodegeneración, lo que respalda su relevancia como un nodo que conecta el estrés del RE con la señalización por ubiquitina.

Rfp2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRIM13 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rfp2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRIM13 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRIM13, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rfp2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRIM13 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rfp2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rfp2 en células tumorales con expresión de TRIM13 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.