Ret CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400311-ACT

RET kodiert Ret, eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die durch Liganden der GDNF-Familie über GFRα-Korezeptoren aktiviert wird und so Zellüberleben, Differenzierung und Migration reguliert. Die Ret-Signalübertragung läuft über die MAPK/ERK-, PI3K/AKT-, PLCγ- und RAS-Signalwege und prägt Entwicklungsprogramme in aus der Neuralleiste hervorgegangenen Zelllinien sowie die Nierenmorphogenese. Eine fehlregulierte RET-Expression oder -Aktivität ist an onkogenen Signalnetzwerken und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen beteiligt, wodurch RET häufig als Knotenpunkt zur Untersuchung von Rezeptor-Tyrosinkinase-Cross-Talk, Linienspezifizierung und signalabhängigen transkriptionellen Antworten genutzt wird.

Ret Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RET-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ret Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RET-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RET-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ret-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RET-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ret-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ret-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RET-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.