Plasmide CRISPR d'Activation (h) Repo-Man: sc-405105-ACT

CDCA2 code Repo-Man, une sous-unité de ciblage associée à la chromatine qui recrute la protéine phosphatase 1 (PP1) sur les chromosomes en mitose ainsi que dans le noyau en anaphase/télophase, afin de coordonner les événements de déphosphorylation lors de la sortie de mitose. Repo-Man contribue au rétablissement de l’architecture de la chromatine en interphase et à la régulation des états de phosphorylation des histones, reliant la progression du cycle cellulaire au contrôle transcriptionnel et épigénétique. Par ses rôles dans la ségrégation des chromosomes, la synchronisation de la réplication de l’ADN et la réassemblage du noyau, une activité altérée de CDCA2 est fréquemment étudiée dans le contexte de la signalisation proliférative et de la stabilité du génome. La dérégulation des processus dépendants de Repo-Man–PP1 est pertinente dans des modèles de dysfonctionnement des points de contrôle du cycle cellulaire et de remodelage de la chromatine associé au cancer.

Repo-Man Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDCA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Repo-Man Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDCA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDCA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Repo-Man. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDCA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Repo-Man au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Repo-Man dans les cellules tumorales présentant une expression de CDCA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.