Ref-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400932-ACT

APEX1 codifica a Ref-1 (APE1), uma endonuclease apurínica/apirimidínica essencial que coordena o reparo por excisão de bases ao clivar sítios abásicos no DNA gerados após dano oxidativo, alquilação ou perda espontânea de bases. Além do reparo do DNA, a Ref-1 também atua como reguladora redox, modulando a atividade de ligação ao DNA de fatores de transcrição envolvidos em sinalização de estresse e inflamação, incluindo AP-1, NF-κB e HIF-1. Por meio dessas funções, APEX1 sustenta a estabilidade do genoma, a tolerância a danos associados à replicação e as respostas celulares às espécies reativas de oxigênio. A atividade desregulada de APEX1 e o equilíbrio alterado entre funções redox e de reparo têm sido associados à biologia tumoral, à neurodegeneração e a patologias inflamatórias, tornando-o um ponto-chave para estudos mecanísticos das respostas a danos no DNA.

Ref-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APEX1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ref-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APEX1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APEX1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ref-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APEX1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ref-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ref-1 em células tumorais com expressão de APEX1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.