REDD-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401797-ACT

Il gene umano **DDIT4** codifica **REDD-1**, un regolatore inducibile dallo stress che integra segnali di ipossia, danno al DNA, stress del reticolo endoplasmatico (ER) e deprivazione di nutrienti per limitare l’attività di **mTORC1** tramite una modulazione a monte dell’asse **TSC1/2–Rheb**. Attenuando i programmi di crescita anabolica, REDD-1 influenza la sintesi proteica, l’autofagia, il metabolismo mitocondriale e l’omeostasi redox, modellando l’adattamento cellulare a microambienti variabili. Un’alterata espressione di DDIT4/REDD-1 è stata riportata in diversi contesti caratterizzati da stress metabolico e da una deregolazione della segnalazione di mTOR, inclusi l’oncologia, le neurodegenerazioni e gli stati infiammatori, dove può incidere su sopravvivenza e tolleranza allo stress. In quanto nodo trascrizionalmente responsivo, REDD-1 è spesso utilizzato per studiare l’accoppiamento tra la segnalazione **HIF-1**, il sensing energetico dipendente da **AMPK** e gli output di crescita controllati da mTOR.

REDD-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDIT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

REDD-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDIT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDIT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di REDD-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDIT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da REDD-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via REDD-1 nelle cellule tumorali con espressione di DDIT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.