RBM35B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408008-ACT

Humanes ESRP2 (RBM35B) kodiert ein epitheliales, spleißregulatorisches Protein, das an Prä‑mRNA bindet und alternative Spleißprogramme steuert, die zur Aufrechterhaltung der epithelialen Identität und der Architektur von Zell‑Zell‑Kontakten beitragen. Durch die Regulation von Spleißisoformen in Signalwegen, die die Zytoskelettdynamik, Adhärenzverbindungen und die epitheliale–mesenchymale Transition (EMT) kontrollieren, leistet ESRP2 einen Beitrag zur kontextabhängigen Steuerung von Differenzierung, Migration und Signalübertragung. Eine veränderte ESRP2‑Expression oder Spleißaktivität wurde mit aberranten, EMT‑assoziierten Transkriptomen und einer fehlregulierten RNA‑Prozessierung in verschiedenen Tumor‑ und Entwicklungsmodellen in Verbindung gebracht. Als Knotenpunkt, der RNA‑Bindungsspezifität mit isoformaufgelöster Genregulation verknüpft, wird ESRP2 häufig genutzt, um spleißgetriebene phänotypische Umschaltprozesse und das Umverdrahten von Signalwegen zu untersuchen.

RBM35B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ESRP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RBM35B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ESRP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ESRP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RBM35B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ESRP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RBM35B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RBM35B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ESRP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.