Plasmide CRISPR d'Activation (h) RB1CC1: sc-416259-ACT

RB1CC1 humain (également appelé FIP200) est un composant central du complexe d’initiation de l’autophagie ULK1 et coordonne la formation précoce des autophagosomes en réponse aux signaux liés aux nutriments et à l’énergie. Par ses interactions avec ULK1/2, ATG13 et ATG101, RB1CC1 relie les voies de signalisation régulées par l’AMPK et mTOR au flux autophagique, tout en contribuant à l’organisation du cytosquelette et à la prise en charge sélective des cargos. L’autophagie dépendante de RB1CC1 influence le contrôle qualité des mitochondries, la protéostase et l’adaptation cellulaire au stress. La dérégulation des voies associées à RB1CC1 a été impliquée dans des contextes pertinents pour la biologie tumorale et la neurobiologie, ce qui en fait un nœud mécanistique utile pour étudier le contrôle de la croissance, les réponses au stress et les interactions entre voies de signalisation.

RB1CC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RB1CC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RB1CC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RB1CC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RB1CC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RB1CC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RB1CC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RB1CC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RB1CC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RB1CC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.