Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ras-GRF2: sc-404141-ACT

Le gène humain **RASGRF2** code **Ras-GRF2**, un facteur d’échange de nucléotides guanyliques régulé par le calcium et le diacylglycérol, qui active **RAS** et peut moduler la signalisation **RAC**, reliant les signaux extracellulaires à la dynamique intracellulaire de la cascade **MAPK/ERK**. Ras-GRF2 intègre des signaux provenant des récepteurs à activité tyrosine kinase et des voies associées aux **GPCR** afin d’influencer la prolifération, la différenciation, le remodelage du cytosquelette et des voies de signalisation liées à la plasticité neuronale. Dans le système nerveux, il contribue à la signalisation dépendante de l’activité et à la fonction synaptique, tandis que dans d’autres contextes cellulaires, il peut reprogrammer des programmes transcriptionnels induits par les facteurs de croissance via des effecteurs dépendants d’ERK. La dérégulation de la voie RAS est largement impliquée dans des phénotypes oncogéniques et neurodéveloppementaux, faisant de **RASGRF2** un nœud utile pour disséquer l’activation de RAS et le contrôle par rétroaction de manière spécifique au contexte.

Ras-GRF2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RASGRF2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ras-GRF2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RASGRF2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RASGRF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ras-GRF2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RASGRF2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ras-GRF2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ras-GRF2 dans les cellules tumorales présentant une expression de RASGRF2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.