Plasmide CRISPR d'Activation (m) RARβ/Retinoic Acid Receptor β: sc-432322-ACT

Rarb code RARβ, un récepteur nucléaire activé par un ligand qui forme un hétérodimère avec RXR et se lie à des éléments de réponse à l’acide rétinoïque afin de réguler des programmes transcriptionnels contrôlant les décisions de destinée cellulaire. Dans les cellules de souris, RARβ intègre la signalisation des rétinoïdes au remodelage de la chromatine pour coordonner la différenciation, la mise en place des tissus et le contrôle homéostatique de la prolifération et de l’apoptose. L’activité de RARβ s’articule avec des réseaux de gènes du développement et du métabolisme et influence la spécification des lignages neuronaux et épithéliaux. Une expression dérégulée de Rarb ou une altération de la signalisation en aval est fréquemment étudiée dans le contexte d’une différenciation aberrante, de modifications des fonctions immunitaires et de barrière, ainsi que de la reprogrammation transcriptionnelle associée au cancer.

RARβ/Retinoic Acid Receptor β Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rarb sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RARβ/Retinoic Acid Receptor β Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rarb dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rarb, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RARβ/Retinoic Acid Receptor β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rarb natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RARβ/Retinoic Acid Receptor β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RARβ/Retinoic Acid Receptor β dans les cellules tumorales présentant une expression de Rarb silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.