RANK Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-400559

Descripción general

TNFRSF11A codifica RANK (receptor activador de NF-κB), un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que actúa como un nodo clave de señalización en la diferenciación de osteoclastos y la remodelación ósea. Tras unirse a RANKL, RANK inicia cascadas dependientes de TRAF que activan los programas de NF-κB, MAPK y NFATc1, los cuales controlan el compromiso del linaje mieloide, la supervivencia y la expresión de genes inflamatorios. La señalización de RANK también contribuye a la comunicación cruzada entre epitelio e sistema inmunitario e influye en vías de migración y supervivencia celular. La actividad desregulada del eje RANK/RANKL está implicada en trastornos óseos osteolíticos, pérdida ósea inflamatoria e interacciones entre tumores y el microambiente óseo, lo que convierte a TNFRSF11A en una diana frecuente en estudios mecanísticos de biología esquelética e inmunitaria.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO RANK (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen TNFRSF11A en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus TNFRSF11A, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR RANK (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido TNFRSF11A.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido RANK CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto TNFRSF11A.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus TNFRSF11A y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones TNFRSF11A críticos para la función RANK
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.