RANK CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423439-ACT

Mouse Tnfrsf11a kodiert RANK, ein Mitglied der TNF‑Rezeptor‑Superfamilie, das als zentraler Signaltransduktor für die RANKL‑abhängige Kommunikation zwischen Immun‑, Knochen‑ und Stromakompartimenten fungiert. Die Aktivierung von RANK rekrutiert TRAF‑Adapter, um die Signalwege NF‑κB, MAPK (ERK/JNK/p38) und PI3K–AKT zu stimulieren, und koordiniert damit Programme der Osteoklastendifferenzierung, des Überlebens sowie der Expression entzündungsrelevanter Gene. In vivo und in vitro ist eine veränderte Aktivität des RANK‑Signalwegs eng mit einer dysregulierten Knochenremodellierung und einer gestörten Wechselwirkung im Immunmikromilieu verknüpft, was Tnfrsf11a zu einem Schlüsselknoten für die Untersuchung der Osteoimmunologie und der Gewebehomöostase macht. Als Rezeptor mit kontextabhängigen Outputs bietet RANK einen gut zugänglichen Einstiegspunkt, um nachgeschaltete transkriptionelle Netzwerke und ligandengesteuerte zelluläre Phänotypen zu analysieren.

RANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tnfrsf11a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tnfrsf11a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tnfrsf11a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RANK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tnfrsf11a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RANK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RANK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tnfrsf11a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.