Rad21 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402348-ACT

Humanes RAD21 kodiert Rad21, eine zentrale Untereinheit des Cohesin-Komplexes, der die Kohäsion der Schwesterchromatiden, die höherrangige Chromatinorganisation und die langreichweitige Enhancer-Promotor-Kommunikation vermittelt. Über die Funktionen von Cohesin bei der Etablierung der Kohäsion in der S-Phase und der mitotischen Chromosomensegregation unterstützt Rad21 die Genomstabilität und koordinierte Transkriptionsprogramme. Die RAD21-Funktion überschneidet sich mit Signalwegen der DNA-Schadensantwort und der Zellzykluskontrolle, und eine Fehlregulation von Cohesin-Komponenten wird mit chromosomaler Instabilität und veränderten Genexpressionsmustern in unterschiedlichen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht. Daher wird RAD21 in menschlichen Zellen häufig im Zusammenhang mit Mechanismen von Replikationsstress, Chromatin-Looping und Transkriptionsregulation untersucht.

Rad21 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAD21-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rad21 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAD21-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAD21-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rad21-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAD21-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rad21-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rad21-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAD21-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.