Rab GDI β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404136-ACT

GDI2 kodiert den Rab-GDP-Dissoziationsinhibitor beta (Rab GDIβ), ein zytosolisches Chaperon, das an preny­lierte Rab-GTPasen bindet und deren Ablösung von Membranen, Recycling sowie den Transport aus dem Zytosol zur Membran steuert. Durch die Regulation der Rab-Aktivierungszyklen unterstützt Rab GDIβ vesikuläre Transportwege, die für Endozytose, Exozytose und Organell-Dynamik essenziell sind, einschließlich des Transports im Golgi-Apparat und in endosomalen Kompartimenten. Eine gestörte Homöostase von Rab-GTPasen und eine fehlerhafte Kontrolle des Traffickings stehen mit dysregulierter Rezeptorsignalgebung, Antigenpräsentation und metabolischer Anpassung in Zusammenhang – Prozesse, die häufig an der Biologie von Krebs sowie neurodegenerativen und entzündlichen Erkrankungen beteiligt sind. Als zentraler Koordinator von Rab-Lokalisation und -Verfügbarkeit wird GDI2 häufig untersucht, um Defekte im Membrantransport mit nachgeschalteten Veränderungen in Signalwegen und Zellphänotypen zu verknüpfen.

Rab GDI β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GDI2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab GDI β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GDI2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GDI2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab GDI β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GDI2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab GDI β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab GDI β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GDI2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.