Plásmido CRISPR de Activación (h) Rab 9A: sc-416915-ACT

RAB9A codifica Rab 9A, una pequeña GTPasa que regula la dinámica de los endosomas tardíos y el tráfico retrógrado desde los endosomas tardíos hacia la red trans-Golgi. Al coordinar la gemación de vesículas, el transporte y la fusión de membranas, Rab 9A favorece la clasificación endosomal, la homeostasis lisosomal y el reciclaje de cargas como los receptores de manosa-6-fosfato. Este eje de tráfico se interseca con las vías de autofagia-lisosoma y con redes más amplias de tráfico de membranas que determinan la proteostasis y la señalización celulares. La desregulación del transporte endosomal y de la actividad de las GTPasas Rab se ha vinculado con mecanismos relevantes para la neurodegeneración, el tráfico intracelular de patógenos y la biología de las células cancerosas, lo que convierte a RAB9A en un nodo útil para estudios mecanísticos.

Rab 9A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAB9A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rab 9A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAB9A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAB9A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rab 9A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAB9A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rab 9A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rab 9A en células tumorales con expresión de RAB9A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.