Rab 8A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404285-ACT

RAB8A kodiert die kleine GTPase Rab8A, einen zentralen Regulator des post-Golgi-Membrantransports, der polarisierte Exozytose, Vesikelknospung und -tethering während der Lieferung von Fracht zur Plasmamembran und zum primären Zilium koordiniert. Rab8A wirkt im Zusammenspiel mit GEFs und Effektoren, um die Dynamik von Recycling-Endosomen, die Ziliogenese und die Organisation des Zytoskeletts zu steuern und beeinflusst dadurch Zellpolarität und gerichtete Migration. Über diese Funktionen ist RAB8A an Signalwegen beteiligt, die mit der Biologie von Ziliopathien und der Entwicklungs-Signalgebung verknüpft sind; eine Fehlregulation wurde in krebsbezogenen Kontexten mit veränderten Sekretionsprogrammen und invasivem Zellverhalten in Verbindung gebracht. Rab8A-abhängiger Transport steht außerdem in Wechselwirkung mit neuronalem Transport und autophagiebezogenem Membranumbau, was Rab8A für mechanistische Studien in unterschiedlichen Geweben relevant macht.

Rab 8A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB8A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 8A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB8A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB8A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 8A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB8A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 8A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 8A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB8A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.