Plásmido CRISPR de Activación (h) Rab 32: sc-403733-ACT

RAB32 codifica Rab32, una pequeña GTPasa de la familia RAB que regula el tráfico intracelular de membranas, incluido el transporte entre endosomas, orgánulos relacionados con lisosomas y compartimentos asociados a las mitocondrias. Rab32 participa en la gemación de vesículas, la clasificación de carga y la homeostasis de los orgánulos, conectando el tráfico dependiente de Rab con la dinámica mitocondrial y las respuestas celulares al estrés. A través de su función en el tráfico y el control de calidad de los orgánulos, la actividad alterada de RAB32 se ha asociado con inflamación desregulada y un metabolismo celular aberrante en contextos relevantes para la enfermedad. Estas funciones hacen de RAB32 un nodo útil para estudiar vías de transporte vesicular, biogénesis de orgánulos y redes de señalización que dependen de la localización compartimentalizada de proteínas.

Rab 32 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAB32 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rab 32 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAB32 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAB32, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rab 32. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAB32 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rab 32 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rab 32 en células tumorales con expresión de RAB32 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.