Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 15: sc-415722-ACT

RAB15 code Rab15, une petite GTPase apparentée à Ras qui régule le trafic membranaire endosomal en alternant entre des états liés au GDP et au GTP, et en coordonnant le bourgeonnement, le transport et la fusion des vésicules. L’activité de Rab15 a été associée à l’endocytose des récepteurs et à des choix de tri qui modulent l’amplitude de la signalisation et l’absorption de nutriments, en interaction avec des processus dépendants des Rab impliqués dans le recyclage endocytique et l’adressage aux lysosomes. Par son rôle dans la dynamique des endosomes, Rab15 peut influencer des voies qui gouvernent le métabolisme cellulaire, l’homéostasie des récepteurs membranaires et la transduction de signaux spécifique des compartiments. Des altérations d’expression ou de fonction des protéines Rab endocytiques, dont Rab15, sont fréquemment étudiées dans des contextes tels que la reprogrammation de la signalisation oncogénique, la neurobiologie et la régulation des cellules immunitaires, où les phénotypes dépendants du trafic intracellulaire sont marqués.

Rab 15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB15 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB15 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB15, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 15. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB15 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 15 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 15 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB15 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.