Rab 14 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402109-ACT

RAB14 codiert Rab14, eine kleine GTPase der RAS-Superfamilie, die den Membrantransport koordiniert, indem sie zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt und so das Abschnüren, den Transport und die Fusion von Vesikeln steuert. Rab14 reguliert das endozytotische Recycling sowie den biosynthetischen Transport zwischen dem trans-Golgi-Netzwerk, frühen/recycling Endosomen und der Plasmamembran und beeinflusst dadurch die Sortierung von Frachtproteinen, den Rezeptorumsatz und den polarisierten Transport. Über diese Prozesse trägt RAB14 zur Aufrechterhaltung der Zellpolarität, zur Verteilung von Nährstofftransportern und zur Dynamik der Signaltransduktion bei. In der Literatur wird eine veränderte, Rab14-gesteuerte Trafficking-Regulation mit fehlregulierten Proliferations- und Migrationsprogrammen in verschiedenen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, was RAB14 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien vesikeltransportabhängiger Phänotypen macht.

Rab 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.