Plasmide CRISPR d'Activation (m) Rab 10: sc-422551-ACT

Rab10 code Rab10, une petite GTPase apparentée à Ras qui coordonne le trafic membranaire en régulant le bourgeonnement des vésicules, leur transport, leur arrimage et leur fusion entre les endosomes, les voies de recyclage et le réseau trans-Golgi. Dans les cellules de souris, l’activité de Rab10 soutient l’exocytose polarisée, le trafic des vésicules GLUT4, la maturation des autophagosomes et le recyclage des récepteurs, ce qui la relie à la signalisation PI3K–AKT, au tri endosomal et à la dynamique du cytosquelette. Une perturbation du trafic dépendant de Rab10 a été associée à une réponse à l’insuline altérée, à des modifications de la fonction des cellules immunitaires et à un déséquilibre de l’homéostasie neuronale, faisant de Rab10 un nœud d’intérêt pour étudier, in vivo et sur modèles en culture, des voies pertinentes pour le métabolisme et la neurodégénérescence.

Rab 10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rab10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rab10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rab10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rab10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 10 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rab10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.