Pyrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403193-ACT

MEFV kodiert Pyrin, ein zytosolisches Mustererkennungsprotein, das die Inflammasom-Signalübertragung und die Homöostase der angeborenen Immunantwort in menschlichen myeloischen Zellen reguliert. Pyrin erkennt pathogenen- oder gefahrenassoziierte Störungen, die die Rho-GTPase-Signalgebung und die Zytoskelettdynamik beeinflussen, und koordiniert den Zusammenbau von Inflammasom-Komplexen, welche die Caspase-1-Aktivität und die nachgeschaltete Prozessierung von Zytokinen der IL‑1-Familie steuern. Über diese Signalwege hilft Pyrin, die Entzündungsschwelle und programmierte entzündliche Reaktionen feinzujustieren, und verknüpft die Überwachung des Zytoskeletts mit NF‑κB- sowie Zytokin-Signalnetzwerken. Eine dysregulierte MEFV/Pyrin-Aktivität ist genetisch mit autoinflammatorischen Phänotypen assoziiert, weshalb sie einen häufig untersuchten Knotenpunkt in der Forschung zu Entzündungssignalwegen und Wirtsabwehr darstellt.

Pyrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MEFV-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pyrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MEFV-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MEFV-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pyrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MEFV-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pyrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pyrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MEFV-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.