PXDN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404707-ACT

Il gene umano **PXDN** codifica la peroxidasina, una perossidasi eme secreta della matrice extracellulare (ECM) che catalizza i legami crociati sulfiliminici nel collagene IV, sostenendo l’assemblaggio della membrana basale e l’integrità dei tessuti. Attraverso l’attività enzimatica ossidativa e il rimodellamento dell’ECM, **PXDN** influenza l’adesione cellula–matrice, la migrazione e la funzione di barriera vascolare ed epiteliale. Un’espressione o un’attività disregolata di **PXDN** è stata collegata a fenotipi dello sviluppo e oculari ed è stata studiata in contesti di fibrosi, infiammazione e rimodellamento del microambiente tumorale. In quanto enzima redox associato all’ECM, **PXDN** rappresenta un nodo utile per studiare la dinamica della membrana basale e la segnalazione ossidativa in modelli cellulari e di organoidi.

PXDN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PXDN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PXDN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PXDN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PXDN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PXDN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PXDN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PXDN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PXDN nelle cellule tumorali con espressione di PXDN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.