PSS2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404133-ACT

Das humane PTDSS2 kodiert die Phosphatidylserin-Synthase 2 (PSS2), ein Membranenzyme des endoplasmatischen Retikulums, das die Bildung von Phosphatidylserin über einen Basenaustausch mit Phosphatidylethanolamin katalysiert. Durch die Kontrolle der zellulären Phosphatidylserin-Menge trägt PSS2 zur Regulation der Membranbiogenese, der Organellenhomöostase, des vesikulären Transports sowie lipidabhängiger Signalprozesse bei, die Apoptose und phagozytische Clearance beeinflussen. Die Aktivität von PTDSS2 ist eng mit Phospholipid-Remodelling-Pathways und dem Lipidaustausch zwischen ER und Mitochondrien verknüpft und prägt dadurch die mitochondriale Funktion sowie zelluläre Stressantworten. Eine Fehlregulation des Phosphatidylserin-Stoffwechsels wurde mit veränderten Wachstums- und Überlebensphänotypen bei Krebs sowie mit breiteren, stoffwechsel- und neurobiologisch relevanten Membrandefekten in Verbindung gebracht, was PTDSS2 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien macht.

PSS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTDSS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PSS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTDSS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTDSS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PSS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTDSS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PSS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PSS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTDSS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.