Plásmido CRISPR de Activación (h) PRP8: sc-402819-ACT

PRPF8 codifica PRP8, un componente central altamente conservado de la ribonucleoproteína nuclear pequeña U5 dentro del espliceosoma de tipo U2, donde ayuda a coordinar la formación del centro catalítico y la ligación de exones durante el empalme del pre-ARNm. A través de sus amplias interacciones con los ARN y las proteínas del espliceosoma, PRP8 favorece el reconocimiento de los sitios de empalme, la dinámica de ensamblaje del espliceosoma y la integridad del transcriptoma en diversos programas génicos. La alteración de la función de PRPF8 puede desorganizar los patrones de empalme alternativo, lo que conduce a cambios generalizados en el procesamiento del ARN y en vías downstream vinculadas al control del ciclo celular, las respuestas al daño del ADN y la proteostasis. La actividad aberrante del espliceosoma en la que participa PRPF8 se ha asociado con trastornos hereditarios de la retina y se ha estudiado en el contexto de la desregulación del espliceosoma observada en neoplasias malignas y otras enfermedades caracterizadas por un procesamiento del ARN alterado.

PRP8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRPF8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PRP8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRPF8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRPF8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PRP8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRPF8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PRP8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PRP8 en células tumorales con expresión de PRPF8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.