Protamine 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402496-ACT

PRM1 codifica la protamina 1, una proteina nucleare altamente ricca di arginina che, nelle fasi tardive della spermiogenesi, sostituisce gli istoni per promuovere un’estrema compattazione della cromatina negli spermatidi aploidI. Questa transizione è fondamentale per la condensazione della testa dello spermatozoo, la stabilizzazione del genoma e il corretto impacchettamento del DNA paterno, ed è coordinata con eventi di rimodellamento della cromatina, riparo del DNA e riprogrammazione epigenetica nella linea germinale maschile. Un’espressione alterata di PRM1 o uno squilibrio tra protamine è associato, negli studi sull’infertilità da fattore maschile, a una struttura anomala della cromatina spermatica, a un aumento della frammentazione del DNA e a una compromissione della funzione spermatica. In quanto componente della cromatina specifico delle cellule germinali, PRM1 è anche utilizzato come marcatore per analizzare i programmi di maturazione degli spermatozoi e la regolazione della trascrizione specifica degli spermatidi.

Protamine 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Protamine 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Protamine 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Protamine 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Protamine 1 nelle cellule tumorali con espressione di PRM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.