Protamine 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402496-ACT

PRM1 kodiert Protamin 1, ein stark argininreiches nukleäres Protein, das in der späten Spermiogenese Histone ersetzt und so eine extreme Chromatinkondensation in haploiden Spermatiden bewirkt. Dieser Übergang ist zentral für die Kondensation des Spermienkopfes, die Stabilisierung des Genoms und die korrekte Verpackung der väterlichen DNA und ist mit Chromatin-Remodeling-, DNA-Reparatur- und epigenetischen Reprogrammierungsprozessen in der männlichen Keimbahn koordiniert. Eine veränderte PRM1-Expression oder ein Ungleichgewicht der Protaminkomponenten wird in Studien zur männlichen Infertilität mit einer abnormalen Spermienchromatinstruktur, erhöhter DNA-Fragmentierung und eingeschränkter Spermienfunktion in Verbindung gebracht. Als keimzell-spezifische Chromatinkomponente wird PRM1 außerdem als Marker verwendet, um Programme der Spermienreifung sowie die Regulation der spermatidenspezifischen Transkription zu untersuchen.

Protamine 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Protamine 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Protamine 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Protamine 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Protamine 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.