PRK2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407649-ACT

PKN2 kodiert die Proteinkinase N2 (PRK2), eine Serin/Threonin-Kinase der AGC-Familie, die als Effektor der Rho-Familie von GTPase-Signalwegen fungiert und die Zytoskelettdynamik, den Umsatz fokaler Adhäsionen sowie die Zellmotilität koordiniert. Die PRK2-Aktivität integriert Signale aus GPCR- und wachstumsfaktorassoziierten Signalwegen und beeinflusst dadurch die Aktin-Remodellierung, die Bildung von Stressfasern und den Vesikeltransport, mit nachgeschalteten Effekten auf Proliferations- und Überlebensprogramme. Über diese Funktionen wird PRK2 mit Prozessen in Verbindung gebracht, die für die Invasion von Tumorzellen und metastatisches Verhalten relevant sind, ebenso wie mit einer allgemeineren Fehlregulation von Migration und adhäsionsabhängiger Signalübertragung, wie sie in unterschiedlichen Krankheitskontexten beobachtet wird. Die Modulation der endogenen PKN2-Expression ist daher nützlich, um die Vernetzung von Signalwegen zwischen Rho/ROCK-assoziierter Signalgebung, zytoskelettaler Organisation und transkriptionellen Outputs zu untersuchen.

PRK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PKN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PKN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PKN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PKN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PKN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.