Plásmido CRISPR de Activación (h) PRK2: sc-407649-ACT

PKN2 codifica la proteína quinasa N2 (PRK2), una quinasa de serina/treonina de la familia AGC que actúa como efector de la señalización de las GTPasas de la familia Rho para coordinar la dinámica del citoesqueleto, la renovación de las adhesiones focales y la motilidad celular. La actividad de PRK2 integra señales procedentes de vías acopladas a GPCR y a factores de crecimiento para influir en la remodelación de actina, la formación de fibras de estrés y el tráfico vesicular, con efectos posteriores sobre programas de proliferación y supervivencia. A través de estas funciones, PRK2 se ha implicado en procesos relevantes para la invasión de células tumorales y el comportamiento metastásico, así como en una desregulación más amplia de la migración y de la señalización dependiente de adhesión observada en diversos contextos patológicos. Por ello, modular la expresión endógena de PKN2 resulta útil para diseccionar la conectividad entre la señalización asociada a Rho/ROCK, la organización del citoesqueleto y las salidas transcripcionales.

PRK2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PKN2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PRK2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PKN2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PKN2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PRK2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PKN2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PRK2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PRK2 en células tumorales con expresión de PKN2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.